細胞轉染簡介
細胞轉染簡介
細胞轉染，是指將外源基因導入細胞內的一種技術。根據(jù)哺乳動物細胞蛋白表達流程，細胞培養(yǎng)完成后需進行細胞轉染，根據(jù)不同的實驗目的選擇不同的轉染方法。目前，常用的細胞轉染方法主要分為三類途徑：物理介導（電穿孔法，基因槍法、顯微注射法）、化學介導（脂質體轉染法、磷酸鈣共沉淀法、陽離子聚合物介導法）、生物介導（病毒介導轉染、原生質體轉染）。
理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。目前實驗室常用的轉染方法有脂質體轉染，陽離子聚合物轉染和病毒轉染，不同的轉染方法各有利弊，針對細胞的習性和不同的實驗目的可選擇相對合適的轉染方法。
一般來說，原代細胞轉染難度是比較大的，雖然眾所周知，原代細胞研究具有非常重要的生物學意義，但是轉染效率低下一直是制約其發(fā)展的主要因素。
本文我們主要介紹一種常用的適用于原代細胞的轉染方法：脂質體介導轉染法。
---陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，其轉染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質體對細胞有一定的毒性，所以轉染時間一般不超過24小時。
常用的脂質體主要有兩種，Lipofectin和Lipofectamine。前者是一種陽離子脂質試劑，可與靶DNA的磷酸骨架結合形成復合物，該復合物能輕易通過細胞膜從而完成轉染過程。Lipofectin可用于轉染DNA、RNA和寡核苷酸至各種動物細胞，并可將DNA導入植物原生質體。Lipofectamine是一種多陽離子轉染試劑，其頭部具獨特的精胺基團，該基團的強負電子性使Lipofectamine具有較強的轉染能力。
實驗步驟
(一)貼壁細胞穩(wěn)定表達的轉染
1. 在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種2ml(完全培養(yǎng)基)約1.3×105細胞。
2. 37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)細胞至50-80％豐度。
3. 在兩個1.5ml離心管中準備如下溶液：
溶液A：溶1-2 μg DNA于100μl無血清培養(yǎng)基中
溶液B：溶2-25μl脂質體(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)于100μl無血清培養(yǎng)基中
4. 將上述A、B兩液混合，室溫下放置15-45分鐘。此時可將細胞用2ml無血清培養(yǎng)基漂洗1-2遍。
5. 混合的A、B兩液中加入0.8ml無血清培養(yǎng)基，混勻，平鋪在漂洗過的細胞上。如果細胞對無血清耐受能力差，這一步可加入血清。但是在轉染過程中不要加入***(antibiotic)。
6．37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-24小時。
7. 加入lml培養(yǎng)基(含兩倍于正常濃度的血清)。若血清已加入，這一步可加入lml正常的完全培養(yǎng)基。
8. 在轉染后的18-24小時換入新鮮的完全培養(yǎng)基。
9．根據(jù)細胞類型及啟動子的活性，在24-72小時可對基因的表達活性進行分析。
10. 在轉染后的18-24小時，可將細胞按1:10傳入選擇培養(yǎng)基中進行篩選。
(二)瞬時轉染
1. 用無血清、無***(antibiotic)的培養(yǎng)基漂洗細胞1-2遍。
2．在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種0.8ml(無血清培養(yǎng)基)約2-3×106細胞。
3. 在兩個1.5ml離心管中準備如下溶液：
溶液A：溶1-2μgDNA于100μl無血清培養(yǎng)基中
溶液B：溶2-25μl脂質體(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)無血清培養(yǎng)基中
4．將上述A、B兩液混合，室溫下放置15-45分鐘。
5．將混合液加入細胞懸液中，混勻，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-24小時。
6．加入4ml完全培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)24-72小時．
7．倒掉培養(yǎng)基，藍光激發(fā)下觀察綠色熒光。
